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技術應用
2020年接近尾聲，突如其來的一場疫情給人們的生活帶來巨大影響。中西醫(yī)結合，中藥與西藥聯(lián)用，在病毒感染引起的新冠肺炎治療，挽救生命，戰(zhàn)勝疫情中發(fā)揮著重要作用。但是因為中藥成分多樣，與疾病的相互作用非常復雜，難以分析其有效成分及作用機制，極大地限制了中藥的廣泛使用。近年來，隨著生物信息學和其它分析技術的進展，中藥活性成分表征、鑒定及分子機制方面的研究和應用越來越多，有望使中藥更加造福于現(xiàn)代醫(yī)療。
作為生命科學研究最新手段之一的SPR技術由于其研究分子互作的實時性、超高靈敏度、高專一性、可以同時測定動力學常數(shù)和解離平衡常數(shù)等特點，已成為藥物研發(fā)全流程和質量控制的必需技術，并被2020版中國藥典收錄。同樣，在中藥活性成分的表征鑒定、分子靶標的篩選、候選藥物分子的改造以及藥物質控等方面，SPR也發(fā)揮著非常重要的作用。
- 1. 中藥活性分子直接作用靶點的識別與確證
蘇木酮A(SA)是從傳統(tǒng)中藥蘇木中分離得到的一個天然抗炎活性小分子,抗神經(jīng)炎癥效果明確,但是其作用靶點和機理尚不清楚。北京大學的研究團隊先將蘇木酮A改造成一個活性分子探針,從神經(jīng)小膠質細胞中垂釣到其抗炎靶點蛋白為IMPDH2；然后利用SPR分析確認了蘇木酮A與靶點蛋白IMPDH2之間具有較強的結合能力(KD=3.9 nM)。
2. 天然產(chǎn)物靶向垂釣
基于SPR-MS的垂釣技術能在分子水平上發(fā)現(xiàn)和鑒定新的天然產(chǎn)物藥物，通過將“靶點蛋白”固定在芯片表面，當被檢測樣品流過芯片表面時，未知的互作因子能夠與“靶點蛋白”相結合, 實現(xiàn)對未知相互作用分子的俘獲，再結合質譜等技術鑒定出未知因子結構。
第二軍醫(yī)大學的研究人員以腫瘤壞死因子受體（TNFR）為“捕獲蛋白”，采用SPR垂釣技術進行了5種中藥的篩選和分離，最終從大黃中分離回收得到了TNFR的配體。
3. 先導化合物的優(yōu)化與確認
天然產(chǎn)物雷公藤紅素（celastrol ）能夠很好的抑制腫瘤靶點CDC37的活性。研究人員從celastrol的基本結構（三萜）出發(fā)合成了其他的化合物，然后用分子互作技術測定了所有化合物與藥物靶點CDC37相互作用；通過對其他衍生物的親和力比較，SPR技術給出了這種天然產(chǎn)物的先導化合物改造路徑，為后續(xù)的藥物開發(fā)提供了關鍵作用。
4. 傳統(tǒng)中藥抗病毒機制研究
三萜是一類含疏水五環(huán)骨架的植物次生代謝物，通常認為是植物防御病原體感染的重要化學成分，廣泛存在于自然界。為了揭示這類三萜天然產(chǎn)物廣譜抗病毒的作用機制，北京大學的研究人員利用SPR技術發(fā)現(xiàn)這些三萜物質通過結合到流感、埃博拉和HIV病毒等I型RNA病毒膜蛋白的HR2結構域，抑制了HR1-HR2三聚體發(fā)夾狀結構形成，進而阻礙了病毒-細胞膜融合；最終揭示了三萜天然產(chǎn)物廣譜抗病毒的分子機制。
5. 藥材的質量控制
中國醫(yī)學科學院藥用植物所楊美華研究員帶領的團隊利用Au/Fe3O4納米復合材料為放大標簽，借助英柏生物的表面等離子體共振檢測儀（MI-S200 SPR），實現(xiàn)了多菌靈農(nóng)藥殘留檢測的新方法。研究人員設計了合理的放大模式，利用MI-S200 SPR檢測平臺，檢測多菌靈的檢測下限（LOD）為0.44ng·ml?1；對比酶聯(lián)免疫分析方法，整個分析方法的靈敏度提高了近1個數(shù)量級。利用這種方法檢測了藥材枸杞，其添加回收率102.4%～115.0%，RSD＜10%，檢測結果與UPLC-MS/MS的檢測結果完全一致。該研究成果以“A gold/Fe3O4 nanocomposite for use in a surface plasmon resonance immunosensor for carbendazim”為題發(fā)表在Microchimica Acta上 [1]。
最近發(fā)表的兩篇抗新冠病毒中藥化合物篩選的文章，進一步顯示了SPR在中藥活性成分鑒定及分子機制研究方面發(fā)揮的重要作用[2][3]。
1）Chinese herbal compounds against SARS-CoV-2: Puerarin and quercetin impair the binding of viral S-protein to ACE2 receptor
作者利用中藥系統(tǒng)藥理學分析數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP），以及分子對接分析工具，篩選出與ACE2親和力得分高的兩個分子-葛根素和槲皮素。用SPR分析了它們與ACE2結合的動力學常數(shù)。在SPR上作競爭性抑制實驗，發(fā)現(xiàn)它們可以顯著抑制病毒S蛋白與ACE2的結合。
2）Network pharmacology, molecular docking integrated surface plasmon resonance technology reveals the mechanism of Toujie Quwen Granules against coronavirus disease 2019 pneumonia
第一個用于新冠肺炎的中成藥-透解祛瘟顆粒，可以降低重癥率和死亡率。作者將透解祛瘟顆粒中的所有藥材做了基于SARS-CoV-2病毒靶點的生物信息學分析。分子對接結果顯示其中四個分子（包括槲皮素）得分高于其它化合物。SPR實驗顯示槲皮素更多地與SARS-CoV-2的S蛋白結合，而不是與ACE2結合。
槲皮素與Spike蛋白的SPR實驗，KD=1.69*10e-5M
上述兩篇文章都利用生物信息學工具篩選出有潛在治療作用的化合物，然后將其與新冠病毒的致病靶點（S蛋白和ACE2）做SPR分析，得到動力學常數(shù)，第一篇文章還做了基于SPR的競爭抑制實驗，對分子機制做了一定探討。
值得一提的是，目前已經(jīng)有一項關于槲皮素磷脂復合物作為輔助療法治療新冠肺炎患者的臨床II期實驗在巴基斯坦注冊，目前處于患者招募階段（https://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04578158?cond=quercetin&draw=2&rank=1）。
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參考文獻：
- Li Q, Dou X, Zhao X, Zhang L, Luo J, Xing X, Yang M. A gold/Fe3O4 nanocomposite for use in a surface plasmon resonance immunosensor for carbendazim. Mikrochim Acta. 2019 Apr 30;186(5):313. doi: 10.1007/s00604-019-3402-0. PMID: 31041544.
- Pan B, Fang S, Zhang J, Pan Y, Liu H, Wang Y, Li M, Liu L. Chinese herbal compounds against SARS-CoV-2: Puerarin and quercetin impair the binding of viral S-protein to ACE2 receptor. Comput Struct Biotechnol J. 2020;18:3518-3527. doi:10.1016/j.csbj.2020.11.010. Epub 2020 Nov 11. PMID: 33200026; PMCID: PMC7657012.
- Ye M, Luo G, Ye D, She M, Sun N, Lu YJ, Zheng J. Network pharmacology, molecular docking integrated surface plasmon resonance technology reveals the mechanism of Toujie Quwen Granules against coronavirus disease 2019 pneumonia. Phytomedicine. 2020 Oct 28:153401. doi: 10.1016/j.phymed.2020.153401. Epub ahead of print. PMID: 33191068.